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本制品以RNA为模板，采用预混合技术，用5×HotScript Reaction Mix（已经预混合了HotScript M-MuLV RTase、RNase Inhibitor、dNTP Mixture、Buffer）高效合成第一链cDNA，操作简单。

本制品采用分子进化技术高达60℃的全新高温反转录酶，可以通读GC含量丰富，二级结构复杂的RNA模板，极大提高反转录效率和长度。可用于更长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。本试剂盒中使用了具有DNA分解活性的特殊gDNA Remover，只需一步操作，即可同时完成基因组清除与逆转录反应，极大简化了操作步骤，避免了复杂加样过程造成的样品污染与RNA降解的风险。

• 新一代高温反转录酶极大提高了包括复杂RNA模板的反转录效率和长度。合成cDNA长度高达15kb以上。
  
• 全预混的反转录Mix，只需加入RNA、引物和水，简单快速完成反转录。
  
• gDNA Remover采用先进的一步基因组清除技术，最短时间最简单完成去除基因组DNA步骤。
  
• RNA模板的体积最多可加到总体积的75%，非常适合于低浓度RNA模板的逆转录反应。
  
• 预混Mix在-20℃不冻结，减少了化冻和混匀时间，使用更简单。
  
• 用户可根据需要，可灵活选择Oligo (dT)、Random primer或基因特异引物作为逆转录引物。

• 实验过程中要特别注意避免RNase污染。
  
• 为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。
  
• 可选步骤（一般不需要）：如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构、或者扩增cDNA长度超过3kb，
  可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H2O混匀，65℃变性5分钟，冰上冷却，短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。
  
• 5×HotScript Reaction Mix和gDNA Remover含甘油很粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。5×HotScript Reaction Mix内包含的酶均为过量，即使每次按照3.6μL～3.8μL使用，gDNA Remover按照0.8μL～0.9μL也不影响使用效果。

• 如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo(dT)，与真核生物mRNA的3' Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
  
• 如果对一些物种，不能确定mRNA是否有polyA尾的情况下，首选Oligo(dT)，不成功再尝试基因特异性引物(GSP)和Random primer为引物。
  
• gDNA Remover采用先进的一步基因组清除技术，最短时间最简单完成去除基因组DNA步骤。
  
• 基因特异性引物(GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成，可改用Oligo(dT)或Random primer重新进行逆转录。。
  
• Random primer特异性最低，所有RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA均可以作为Random primer的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo (dT)或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random primer为引物。
  
• 如果合成cDNA下游用于荧光定量PCR，可将Oligo (dT)与Random primer混合使用（各加1μL/20μL反应体系），可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性和重复性。

• 配置反应体系
  

  成分		用量
  模板	Total RNA	50ng～5μg
  	mRNA	5～500ng
  引物	Oligo(dT)(0.5μg/μl)	1μL
  	Random Primer(0.1μg/μl)
  	GSP(Gene Specific Primer,2pmol/μL)
  5×HotScript Reaction Mix		4μL
  gDNA Remover		1μL
  RNase-free H2O		至20μL

  • 如果反转录时不需要去除基因组DNA，直接略去gDNA Remover成分不加即可。
  
  
• 轻轻混匀
  如用Oligo(dT)或基因特异引物(GSP)，50℃孵育30～50min（如产物用于qPCR，50℃孵育15min）
  如用Random Primer，25℃孵育10min，50℃孵育30～50min（如产物用于qPCR，50℃孵育15min）
  
  • 本制品在42℃～60℃反转录均有稳定良好效果。如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可尝试将反应温度提高至55℃～60℃，有助于提高产量。
  
  
• 85℃加热5sec失活HotScript M-MuLV RTase。
  
• 得到的cDNA产物可立即用于PCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。